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究 蛇形毛圆线虫低温保存试验的研究

时间:2016-07-28来源: 作者: 点击: 157次

 

               

 

摘要:为了对蛇形毛圆线虫进行低温保存试验的研究,本研究收集了自然感染有混合虫种的绵羊新鲜粪便,进行了粪便培养及蛇形毛圆线虫单虫种的分离鉴定。采用了最佳冷冻保护剂的筛选、最佳冷冻保存方法试验的筛选及最佳冷冻保存条件的筛选。结果表明,不添加任何保护剂的对照组蛇形毛圆线虫L3存活率较高,经0.1%Naocl脱鞘的蛇形毛圆线虫L3的存活率比未脱鞘的L3存活率显著提高,而采用不同的冷冻方法相比较,差异不显著,但液氮慢速冷冻法对蛇形毛圆线虫L3的存活率相对高一些。随着冷冻时间的延长蛇形毛圆线虫L3的存活率有所下降。

关键词:蛇形毛圆线虫;感染性幼虫;冷冻保藏;存活率

低温保存试验的研究

Study on low temperature preservation test of Trichostrongylus colubriformis

WANG Feng-hui1, WANG Bo-bo2, CAI Kui-zheng2*

(1. Medical College of Yan'an University, Yan'an 716000, China; 2. College of Life Science and Engineering , Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030, China)

 

 

毛圆线虫是胃肠线虫中危害反刍动物健康的主要消化道蠕虫病之一,随着胃肠道寄生性线虫的抗药性、生物防治及功能基因的研究深入,常常需要单一感染的线虫和纯净的感染性幼虫,但常规的保存方法已不适合这方面的研究。在国外,进行冷冻保藏单一虫种已成为一种常规保存的方法。本试验就蛇形毛圆线虫感染性幼虫的保存进行了研究。

1. 材料方法

1.1 蛇形毛圆线虫来源

本研究通过大量的流行病学调查以及在实践基础上,明确了甘肃省榆中县清水乡所养绵羊常常伴有蛇形毛圆线虫、捻转血矛线虫、奥利春细颈线虫等的混合感染,其中蛇形毛圆线虫为优势虫种。挑选3-4月龄、体重约15 kg的健康绵羊1只,收集并培养该地区混合感染有蛇形毛圆线虫的粪便作为本试验的最初研究材料。

1.2蛇形毛圆线虫感染性幼虫单一虫种的分离

按照Van Wyk等所介绍的一种简化的牛羊线虫L3形态学鉴定方法[1],将制备的混合三期幼虫(L3)悬液适量放入直径为8 cm的平皿中,用4 ℃冷却的蒸馏水调节幼虫至适合挑出的浓度。将平皿置于倒置显微镜(Olympus, IX2-SLP, Japan)下用一特制的玻璃毛细吸管,于4×物镜下将尾鞘较短(18-31 μm)、尾端似铅笔尖状、无尾丝的幼虫挑出,放入另一平皿中,备用。

1.5蛇形毛圆线虫冷冻保存方法

1.5.1最佳冷冻保护剂的选择 将冷冻保护剂β-环状糊精、甘油、蔗糖及脱脂奶粉分别加入各含有2000条蛇形毛圆线虫L3的离心管中,每组试验平行3管,另外取不添加任何保护剂的各含有2000条蛇形毛圆线虫L3的三个离心管作为对比。分别冷冻1 h和24 h,观察不同冷冻保护剂对蛇形毛圆线虫L3存活率的影响。

1.5.2最佳冷冻方法的选择 在不添加任何冷冻保护剂时,分别采用液氮保存和-80℃冷冻两种方法,将各含有2000条经0.1%Naocl脱鞘和未进行脱鞘的蛇形毛圆线虫L3各分装于3个离心管中,保存24 h观察不同冷冻方法对蛇形毛圆线虫L3存活率的影响。

1.5.3最佳冷冻时间的选择 在-80℃下,采用甘油冷冻保护剂加入各含有2000条蛇形毛圆线虫L3的离心管中,每组试验平行3管,另外取不添加任何保护剂的三个离心管作为对比,分别冷冻24 h48 h观察对蛇形毛圆线虫L3存活率的影响。

2. 结果

2.1添加不同冷冻保护剂的作用

本试验采用了β-环状糊精、甘油、蔗糖及脱脂奶粉4种不同冷冻保护剂,对蛇形毛圆线虫L3的影响见表1.

1不同冷冻保护剂对蛇形毛圆线虫L3存活率的影响

 

 

冷冻1h后存活的L3

 

冷冻24h后存活的L3

 

 

平均值±SD

存活率%

 

平均值±SD

存活率%

 

β-环状糊精

282.67±102.50a

14.10%

 

572.00±124.53a

28.25%

*

甘油

1065.33±306.23ab

53.25%

 

802.33±55.90ab

40.10%

N.S.

蔗糖

152.00±91.00b

7.60%

 

480.33±12.10bcd

24.00%

*

脱脂奶粉

75867±426.10cd

37.90%

 

388.67±47.82cd

19.40%

N.S.

蒸馏水

110833±76.63d

55.40%

 

1019.67±20.11d

50.95%

N.S.

注:同列肩标不同小写字母的表示差异显著(p0.05,相同小写字母表示差异不显著(p0.05)。

Note: Values with different letters in different same column mean significant difference (P0.05); and with same letters mean no significant difference (p>0.05).

*表示同行相比较,差异显著;N.S.表示差异不显著。

Note: “*” means significant difference (P<0.05) compared with same row and “N.S.” means no significant difference (p>0.05).

由表1可知,在不添加任何冷冻保护剂时,在液氮中冷冻1 h24 h后,蛇形毛圆线虫L3的存活率分别为55%50.95%,加入β-环状糊精、蔗糖、脱脂奶粉在不同冷冻时间后,L3的存活率均不高,而甘油保护剂使L3的存活率并未发生明显变化,结果显示,这几种保护剂与不添加保护剂的对照组相比,效果不佳。

2.2不同冷冻方法的作用

本试验采用了液氮快速冷冻、液氮慢速冷冻及-80℃冷冻3种不同冷冻方法,分别对经0.1%Naocl脱鞘和未进行脱鞘的蛇形毛圆线虫L3的影响见表2.

2. 不同冷冻方法对蛇形毛圆线虫L3存活率的影响

 

 

0.1%Naocl脱鞘

 

未脱鞘

 

 

活的L3平均值±SD

存活率%

 

活的L3平均值±SD

存活率%

 

液氮快速冷冻

1610.67±86.29a

80.53%

 

491.00±6.08b

24.55%

*

液氮慢速冷冻

1695.67±21.78a

84.78%

 

508.67±56.52b

25.43%

*

-80℃冷冻

1634.00±45.13a

81.70%

 

501.00±62.43b

25.05%

*

注:同列肩标不同小写字母的表示差异显著(p0.05,相同小写字母表示差异不显著(p0.05);

Note: Values with different letters in different same column mean significant difference (P0.05); and with same letters mean no significant difference (p>0.05).

*表示同行相比较,差异显著。

Note: “*” means significant difference (P<0.05) compared with same row.

由表2可知,在采用同一种冷冻方法时,经0.1%Naocl脱鞘的蛇形毛圆线虫L3的存活率比未脱鞘的L3存活率显著提高,而采用不同的冷冻方法相比较,差异不显著,但液氮慢速冷冻法对蛇形毛圆线虫L3的存活率相对高一些。

2.3不同冷冻时间的作用

本试验采用了在-80℃中在不同冷冻保护剂冷冻24 h48 h后,分别对蛇形毛圆线虫L3存活率的影响见表3.

 

3. 冷冻24 h对蛇形毛圆线虫L3存活率的影响

 

5%的甘油

 

蒸馏水

 

 

活的L3平均值±SD

存活率%

 

活的L3平均值±SD

存活率%

 

0.1%Naocl脱鞘

1733.00±131.05a

86.65%

 

1634.00±45.13a

81.7%

*

未脱鞘

933.00±105.70b

46.65%

 

489.00±41.68b

24.45%

N.S.

注:同列肩标不同小写字母的表示差异显著(p0.05,相同小写字母表示差异不显著(p0.05)。

Note: Values with different letters in different same column mean significant difference (P0.05); and with same letters mean no significant difference (p0.05).

*表示同行相比较,差异显著;N.S.表示差异不显著。

Note: “*” means significant difference (P<0.05) compared with same row and “N.S.” means no significant difference (p>0.05).

 

4. 冷冻48 h对蛇形毛圆线虫L3存活率的影响

 

 

5%的甘油

 

蒸馏水

 

 

活的L3平均值±SD

存活率%

 

活的L3平均值±SD

存活率%

 

0.1%Naocl脱鞘

1568.00±108.43a

78.40%

 

1360.00±103.52a

68.00%

N.S.

未脱鞘

836.67±111.85b

41.83%

 

421.33±87.79b

21.07%

*

注:同列肩标不同小写字母的表示差异显著(p0.05,相同小写字母表示差异不显著(p0.05)。

Note: Values with different letters in different same column mean significant difference (P0.05); and with same letters mean no significant difference (p>0.05).

*表示同行相比较,差异显著;N.S.表示差异不显著。

Note: “*” means significant difference (P<0.05) compared with same row and “N.S.” means no significant difference (p>0.05).

由表34可知,经0.1%Naocl脱鞘的蛇形毛圆线虫L3的存活率与未脱鞘的L3存活率相比,差异显著,且使用甘油作为冻存保护剂的存活率与未使用保护剂的对照组相比,差异显著。表3、表4相比较,可以得出随着冷冻时间的延长,蛇形毛圆线虫L3的存活率有所下降。

3.讨论

本研究在流行病学的基础上,从自然感染蛇形毛圆线虫的羊群中采集新鲜粪便进行粪便的培养,采用了一种简化的幼虫鉴别技术,从混合L3中分离出蛇形毛圆线虫L3,经口服接种无蠕虫的绵羊[2]。感染后不同时间段的虫卵检查表明,感染17 d可检查到虫卵,虫卵排出持续时间长,最高可达到2752  EPG;感染后排出的粪便,经培养后收集L3和鉴定表明,分离的三期幼虫纯净,其特征与文献记载的蛇形毛圆线虫的L3相符合。胃肠线虫的三期幼虫低温保存在国外已经成为一种很常见的保存方法,Coles [3]已证明经低温保存过的虫种,仍具有很强的感染性。但在这方面还处于落后水平的我国大部分地区来说,由于寄生线虫病频繁发生,给养殖业带来严重的经济损失,常规的虫种保存模式已经不再适用于现阶段的研究,因此针对单一虫种的保存研究是非常有必要的[4]

本试验采用了β-环状糊精、甘油、蔗糖及脱脂奶粉冷冻保护剂的筛选试验,在液氮中分别冷冻1 h24 h后,结果表明实验组与对照组相比,不添加任何保护剂的对照组蛇形毛圆线虫L3存活率较高,保护剂效果不明显。其次,本研究采用了液氮快速冷冻、液氮慢速冷冻及-80 ℃冷冻3种不同冷冻方法,分别对经0.1%Naocl脱鞘和未进行脱鞘的蛇形毛圆线虫感染性幼虫的存活率进行试验,结果表明在采用同一种冷冻方法时,经0.1%Naocl脱鞘的蛇形毛圆线虫L3的存活率比未脱鞘的L3存活率显著提高,而采用不同的冷冻方法相比较,差异不显著,但液氮慢速冷冻法对蛇形毛圆线虫L3的存活率相对高一些,这与窦兰清[5]等结果一致。最后,本试验采用了在-80 ℃中在不同冷冻保护剂冷冻24 h48 h后,分别对蛇形毛圆线虫感染性幼虫存活率的影响的研究,最终发现经0.1%Naocl脱鞘的蛇形毛圆线虫L3的存活率与未脱鞘的L3存活率相比,差异显著,且使用甘油作为冻存保护剂的存活率与未使用保护剂的对照组相比,差异显著,随着冷冻时间的推移,蛇形毛圆线虫L3的存活率有所下降。

参考文献

[1] Van Wyk J A, Cabaret J, Michael L M. Morphological identification of nematode larvae of small ruminants and cattle simplified[J]. Vet Parasitol, 2004, 119: 277–306.

[2] O’Connor L J, Walkden-Brown S W, Kahn L P. Ecology ofthe free-living stages of major trichostrongylid parasites of sheep. Vet Parasitol. 2006, 142: 1–15.

[3] Coles G C, Simpkin K G, Briscoe M G. Routine cryopreservation of ruminant nematode larvae[J]. Res Vet Sci. 1980, 28(3): 391-392.

[4] Chylinski C, Lherminé E, Coquille M, et al. Desiccation tolerance of gastrointestinal nematode third stage larvae: exploring the effects on fitness and the factors influencing survival. Parasitol Res. 2014, doi: 10. 1007/s00436-014-3938-1.

 [5]窦兰清,柴忠威,付宝权,等.毛圆线虫冷冻保藏研究[J].中国兽医寄生虫病,1997,51):11-14

 



收稿日期:2016-05-05

基金项目:陕西省教育厅科学研究计划项目(2013Jk0752)

作者简介:王逢会(1982-),女,硕士,讲师,研究方向为寄生虫生物学。*通讯作者

 

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