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​微生物能力验证中阪崎肠杆菌的分离与鉴定

时间:2016-07-28来源: 作者: 点击: 98次


(宿迁市产品质量监督检验所,江苏 宿迁 223800)

摘要:目的 为了提升微生物实验室对于阪崎肠杆菌的检测能力,提高检测人员的能力素质,本实验参加了中国食品药品检定研究院组织的阪崎肠杆菌能力验证。 方法 依据GB4789.40-2010 采用传统分离方法对考核样品进行分离,借助VITEK2 compact微生物全自动鉴定仪对分离出的可疑菌落进行生化鉴定。结果 编号为CODE2样品+CODE2奶粉的样品、 编号为CODE4样品+CODE4奶粉的样品、 编号为CODE5样品+CODE5奶粉的样品、 编号为CODE8样品+CODE8奶粉的样品检出阪崎肠杆菌,其余6个样品未检出。结论 顺利完成本次能力验证活动。

 关键词:阪崎肠杆菌,能力验证,分离,鉴定

Microorganism proficiency testing results and analysis of  Enterobacter sakazakii

 detection ability

 

LuoYe-qiao

(Suqian Product Quality Supervision and Testing Instution   Jiangsu  223800)

ABSTRACTObjective  To strengthen the decetion capability of Enterobacter sakazakii and improve the ability and quality testing personnel in microbiology laboratory. The laboratory participated in proficiency testing on Enterobacter sakazakii decetion by National Institutes for Food and Drug Control .Methods Traditional separation methods were carried out according to GB 4789.40-2010 .The biochemical identification of isolated suspicious colonies was detected by automated biochenmical identification system (VITEK2 compact).Results  Enterobacter sakazakii were detected in the mixed sample of CODE2 and CODE2 powdered milk ,CODE4 and CODE4,CODE5 and CODE5 powdered milk ,CODE8 and CODE8 powdered milk .But Enterobacter sakazakii was not detected in other 6 samples.Conclusion The proficiency testing was successfully completed

Key words: Enterobacter sakazakii   proficiency testing  isolation  identification

  阪崎肠杆菌属肠杆菌科是肠道中的正常菌群之一,周生鞭毛能运动,无芽孢兼性厌氧的革兰氏阴性杆菌。该菌在一定条件下能引起人和动物致病,是食源性条件致病菌,可导致婴儿脑膜炎和小肠结肠炎等疾病。阪崎肠杆菌是婴幼儿奶粉中重要污染源,与沙门氏菌一起被列为婴幼儿配方奶粉中的A类致病菌[1]

     本文依据GB 4789.40-2010 《食品安全国家标准 食品微生物学检验  阪崎肠杆菌检验》[2]提供的检测方法,结合笔者参加阪崎肠杆菌能力验证的经历,分析总结出阪崎肠杆菌的分离与鉴定过程,旨在为阪崎肠杆菌的分离鉴定提供参考。 

1材料与方法

1.1 待测样品

   食品中阪崎肠杆菌能力验证样品:包括编码为CODE1~1010份西林瓶装的白色球状样品,及对应编号的10袋奶粉样品,每袋质量为100g,每个相同编码的阪崎肠杆菌样品和奶粉样品作为1件样品进行检测。能力验证样品由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 培养基及试剂

   缓冲蛋白胨水(BPW),改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤(MLST),万古霉素,胰蛋白胨大豆琼脂(TSA),均购自广东环凯微生物有限公司;阪崎肠杆菌显色培养基购自北京陆桥技术有限责任公司;VITEK2 GN鉴定卡购自法国生物梅里埃,阪崎肠杆菌(ATCC29544)购自广东省食品微生物安全工程技术研究开发中心菌种保藏中心。

1.3仪器

  thermo 1300series A2生物安全柜,上海森信DRP9272型生化培养箱,Yamato SQ510c高压灭菌锅,Olympus显微镜,Thermo移液枪,生物梅里埃VITEK2 COMPACT 全自动微生物鉴定仪。

1.4实验方法

1.4.1样品前处理及前增菌

     根据中国食品药品检定研究院提供的《阪崎肠杆菌盲样考核作业指导书》要求,在生物安全柜内,取900ml已灭菌BPW增菌液加入到无菌均质袋中,将阪崎肠杆菌样品的西林瓶打开,并将西林瓶内小球加入到BPW增菌液中,充分溶解,然后将与西林瓶相同编码的奶粉样品加入到上述BPW增菌液中,充分均质混匀,制成样品匀液,于36℃±1℃生化培养箱中培养18h 

  取阳性对照菌阪崎肠杆菌(ATCC29544)接种于900ml 已灭菌BPW增菌液,以相同的培养条件下培养,作为此次实验的阳性对照。

1.4.2 增菌

  轻轻摇动上述培养过的样品混合物,取1ml转种于10ml改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(mLST-Vm)肉汤,44℃±0.5℃培养24h

1.4.3选择性分离

轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物,各取增菌培养物1环,分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板,于36℃±1℃培养24±2h。培养结束后观察各平板上有无可疑阪崎肠杆菌菌落。

挑取阪崎肠杆菌可疑菌落5个,划线接种于胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)平板,25℃±1℃培养48±4h

1.4.4 生化试验

   TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落,挑取新鲜培养的单个纯菌落至适量无菌生理盐水中,制成0.5麦氏浊度的均一菌悬液,以0.5麦氏浊度均一菌悬液进行VITEK2鉴定。

2结果分析

2.1增菌和选择性分离结果

从表1可以看出,阪崎肠杆菌待测样品加对应编号的奶粉样品在BPW中出现奶粉发酵现象,接种mLST-Vm培养基后出现浑浊,说明样品中存在能够利用这些培养基进行增殖的微生物。CODE2CODE4CODE5CODE8四份检样中存在三种类型的细菌一种是菌落形态为无色半透明圆形,一种是无色半透明带有黑色中心的菌落,另一种是蓝绿色菌落并且在阪岐肠杆菌显色平板初次化线分离后,单菌落不明显,挑取蓝绿色菌落在阪崎肠杆菌显色平板上继续划线分纯得到蓝绿色圆形菌落,与阪崎肠杆菌显色培养基说明书中的菌落特征一致。CODE1CODE3CODE6CODE7CODE9四份检样的有2种菌落形态一种是菌落形态为无色半透明圆形,一种是无色半透明带有黑色中心的菌落,与之前4个样品的区别在于无典型的阪崎肠杆菌蓝绿色菌落。CODE10样品只包含一种菌落形态即无色半透明圆形。说明在十分样品中所包含的细菌均能通过阪崎肠杆菌选择性增菌肉汤mLST-Vm)肉汤及选择性培养基DFI的筛选。

从表中的TSA平板上可以看出在存在阪岐肠杆菌可疑的CODE2CODE4CODE5CODE8样品的TSA菌落特征为黄色圆形菌落,符合GB4789.40-2010中阪岐肠杆菌在TSA平板上产黄色色素的菌落特征。在TSA平板上CODE1CODE3CODE6CODE7CODE9样品在存在2种菌落形态,CODE10样品只有1种类型的菌落形态。为了能够明确此次能力验证干扰菌的类型,将这几种在选择平板上能够生长的菌落,进行VITEK2的生化实验。

阳性对照阪崎肠杆菌(ATCC29544)在阪岐显色培养基上的菌落特征为蓝绿色圆形,在TSA平板上的菌落特征为黄色圆形菌落。

 

1 阪崎肠杆菌样品增菌结果和选择性分离平板上的菌落特征

Table1  the colony characteristics Of  Enterobacter sakazakii isolated  from selective culture media

样品编号

BPW

mLST-Vm

阪岐显色

TSA

 

CODE1样品

+CODE1奶粉

 

浑浊

 

浑浊

 

无色半透明圆形有的菌落带有黑色中心

 

浅黄色圆形有些菌落弥散生长

 

 

 

 

 

CODE2样品

+CODE2奶粉

浑浊

浑浊

无色半透明圆形有的菌落带有黑色中心、

蓝绿色圆形

浅黄色圆形

黄色圆形

 

 

 

 

 

CODE3样品

+CODE3奶粉

浑浊

浑浊

无色半透明圆形有的菌落带有黑色中心

浅黄色圆形有些菌落弥散生长

 

 

 

 

 

CODE4样品

+CODE4奶粉

浑浊

浑浊

无色半透明圆形有的菌落带有黑色中心、

蓝绿色圆形

浅黄色圆形

黄色圆形

 

 

 

 

 

CODE5样品

+CODE5奶粉

浑浊

浑浊

无色半透明圆形有的菌落带有黑色中心、

蓝绿色圆形

浅黄色圆形

黄色圆形

 

 

 

 

 

CODE6样品

+CODE6奶粉

浑浊

浑浊

无色半透明圆形有的菌落带有黑色中心

浅黄色圆形有些菌落弥散生长

 

 

 

 

 

CODE7样品

+CODE7奶粉

浑浊

浑浊

无色半透明圆形有的菌落带有黑色中心

浅黄色圆形,有些菌落弥散生长

 

 

 

 

 

CODE8样品

+CODE8奶粉

浑浊

浑浊

无色半透明圆形有的菌落带有黑色中心、

蓝绿色圆形

浅黄色圆形

黄色圆形

 

 

 

 

 

CODE9样品

+CODE9奶粉

浑浊

浑浊

无色半透明圆形有的菌落带有黑色中心

浅黄色,有些菌落弥散生长

 

 

 

 

 

CODE10样品

+CODE10奶粉

浑浊

浑浊

无色半透明圆形

浅黄色圆形

黄色圆形

 

 

 

 

 

阳性对照

阪崎肠杆菌(ATCC29544

 

浑浊

 

浑浊

 

蓝绿色圆形

 

黄色圆形

 

2.2生化结果

挑取TSA平板上纯化菌落经VITEK 2 compact 全自动微生物鉴定仪鉴定结果,除CODE10样品外,其他9个样品中均鉴定出大肠埃希氏菌(Escherichia  coli)和泛菌属(Pantoea spp),此外,CODE2CODE4CODE5CODE8样品中分离出阪崎肠杆菌(Cronobacter sakazakii group)这与阳性对照阪崎肠杆菌(ATCC29544)的结果一致。CODE10样品中分离出大肠埃希氏菌(Escherichia  coli)。具体结果见表2

 

2  TSA平板上阪岐肠杆菌可疑菌落的VITEK2 Compact 检验结果

  Table2  The test results of suspicious colonies from TSA plates using VITEK2 Compact

样品编号

 TSA平板菌落形态

及革兰氏染色结果

检验结果

CODE1样品

+CODE1奶粉

浅黄色圆形,  G-

黄色弥散生长,G-

Escherichia  Coli

Pantoea spp

 

 

 

CODE2样品

+CODE2奶粉

浅黄色圆形,  G-

黄色弥散生长,G-

黄色圆形,    G-

Escherichia  Coli

Pantoea spp

Cronobacter sakazakii group

 

 

 

CODE3样品

+CODE3奶粉

浅黄色圆形,  G-

黄色弥散生长,G-

 

Escherichia  Coli

Pantoea spp

 

 

 

 

CODE4样品

+CODE4奶粉

浅黄色圆形,  G-

黄色弥散生长,G-

黄色圆形,    G-

Escherichia  Coli

Pantoea spp

Cronobacter sakazakii group

 

 

 

CODE5样品

+CODE5奶粉

浅黄色圆形,  G-

黄色弥散生长,G-

黄色圆形,    G-

Escherichia  Coli

Pantoea spp

Cronobacter sakazakii group

 

 

 

CODE6样品

+CODE6奶粉

浅黄色圆形,  G-

黄色弥散生长,G-

 

Escherichia  Coli

Pantoea spp

 

 

 

CODE7样品

+CODE7奶粉

浅黄色圆形,  G-

黄色弥散生长,G-

 

Escherichia  Coli

Pantoea spp

 

 

 

 

CODE8样品

+CODE8奶粉

浅黄色圆形,  G-

黄色弥散生长,G-

黄色圆形,    G-

Escherichia  Coli

Pantoea spp

Cronobacter sakazakii group

 

 

 

CODE9样品

+CODE9奶粉

浅黄色圆形,  G-

黄色弥散生长,G-

 

Escherichia  Coli

Pantoea spp

 

 

 

 

CODE10样品

+CODE10奶粉

浅黄色圆形,  G

 

Escherichia  Coli

 

 

阳性对照

阪崎肠杆菌(ATCC29544

 

黄色圆形   G-

 

Cronobacter sakazakii group

 

3结论

能力验证是利用预先制定的准则评价参加实验室的检测条件、技术能力的有效手段,是实验室通过外部措施实现内部质控的有效方法和手段[3]。参加者通过本实验室内部人员比对,及与其他实验室间的结果比对,对检测数据进行分析总结,不仅能够评定其测得数据的可靠性,还能及时发现实验室可能存在的问题,采取纠正措施,有效消除偏差来确保检验质量。

   由于本次能力验证样品为冻干粉+真空包装奶粉,保存温度为2-8℃,收到样品后应尽快检验。其次本次能力验证样品量较大,要求检验人员在检验过程中严格遵守无菌操作要求,避免出现杂菌污染以及不同样品间交叉污染现象。检测过程中以标准菌株作为阳性对照,既能满足对实验试剂,检测环境的质控,又能对操作过程提供参考。但使用标准菌株作为阳性质控菌株应注意避免对检样的污染。能力验证的样品中添加了较多的干扰菌及目标菌,这些细菌在经过BPW 的培养后其生物学特性得到了恢复,整个检验过程检验人员应在生物安全二级实验内进行闭环检验,防止检验人员被感染,保证生物安全。

     本次阪岐肠杆菌能力验证属于定性检验,选择合适的培养基,检验人员的操作水平及经验对于定性检测项目至关重要。与其他肠杆菌的区别在于阪崎肠杆菌能够产生α-D-葡萄糖苷酶,可分解底物5--4-3-吲哚-α-D-吡喃葡萄糖甙产生蓝绿色特征菌落,易于识别,是区分阪崎肠杆菌和其他肠杆菌的可靠方法[4]GB4789.40-2010 以添加了X-GLUDFI作为选择培养基,使得阪崎肠杆菌的可疑菌落易于识别,观察结果直观,选择性好,无假阳性假阴性现象,提高了检出率。从本次的实验结果来看,由于10份样品中都添加了干扰菌,前增菌时间不宜过长,否则会导致干扰菌大量生长抑制目标菌的生长。除CODE10样品外其他9份样品都添加了泛菌导致DFI平板上的目标菌单菌落不明显,以DFI平板进行二次划线复筛,得到较好的阪崎肠杆菌单菌落,再以全自动微生物鉴定仪进行可疑目标菌的生化鉴定,完全机器化操作,避免人为干扰,比较快速的判断样品中是否有阪崎肠杆菌。

目前阪崎肠杆菌的主要分离手段为传统的生理生化检测方法及改进方法,传统检测方法检测过程复杂,检测周期长。随着分子生物学技术的发展,分子检测技术在阪崎肠杆菌检测应用上越来越广泛。高旗利[5]等人运用阪崎肠杆菌的16S-23SrDNA 保守区,优化出一对阪崎肠杆菌的特异性引物,并且与传统理化检测方法结果相符。徐晓可[6]等人评价实验室检测奶粉中阪崎肠杆菌的技术水平和能力, 比较不同方法的检测效果。 对3份样品按照传统方法检测, 同时采用 LAMP方法和PCR方法进行验证,3种结果相符。检测效率上LAMP方法检测时间最短,仅需8h就可以提供检测结果,且操作更简单方便,PCR方法需要1215 h,而传统方法需要 35d。通过比较 3 种方法的检测结果和周期,认为 LAMPPCR 方法可以作为实验室传统验证方法的有效补充。目前国标中尚未确立阪崎肠杆菌的血清学检测方法,仍需进一步研究该菌的血清学检测方法辅助生化鉴定结果,保证结果的准确性[1]

                                                                                   

参考文献

 [1] 陆贞玉.阪崎肠杆菌的生物学特性及检测技术研究进展[J].中国热带医学,2010 ,1010):1275-1277.

[2] GB 4789.40-2010 食品安全国家标准 食品微生物学检验  阪崎肠杆菌检验[S].2010.

[3]席静,张思群,刘静宇等.论能力验证活动对实验室能力建设的作用和意义[J.中国卫生检验杂志,2011,21(6):1576-1578.

 [4]牛振东,刘文杰,孙伟等.阪崎肠杆菌3种检测方法的应用与分析[J].中国乳品工业, 2012,40(9):42-45.

[5]高旗利,张霞. 奶粉中阪崎肠杆菌PCR检测方法研究[J].检验检疫科学,2005,15(4):3-8.

[6]徐晓可,吴清平. 阪崎肠杆菌 LAMPPCR 与传统检测方法的比较[J].现代预防医学, 2013 ,40 (9):1715-1717.

 

 

 

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