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一种创伤弧菌快速药敏试剂盒的研发

时间:2016-07-28来源: 作者: 点击: 89次



摘要:为了建立一种海水鱼弧菌类致病菌的快速药敏试剂盒,设计和筛选了常见弧菌类快速增菌培养基、药物包埋试剂、细菌生长指示剂、10种抗生素8个梯度浓度的定量药敏试剂盒。试剂盒包括试剂盒1和试剂盒2,试剂盒内分为检测区、生长区和空白对照区,每种药物双样对照,通过生物指示剂阿尔玛蓝颜色变化来判断每种药物的最小抑菌浓度。实验结果表明,创伤弧菌在培养基S2里具有较好的生长优势,试剂盒细菌接种浓度为1×105cfu/mL,生物指示剂阿尔玛蓝对细菌生长具有较好的生长指示作用,准确判断每种药物最小抑菌浓度。研究结果表明药敏试剂盒具有准确、简单、快速和方便的特点。

Research and development a rapid drug sensitivity test

kit for vibrio vulnificus

Chen Fuyan1, Ouyang Xianhua, Huang Cailin2

(1 Key Laboratory of aquaculture genetics and breeding and healthy breeding,Guangxi Academy of Fishery Sciences,Nanning 530021, China; 2  Guangxi Aquatic Products Introduction and Breeding Center,Nanning 530031,China)

 

Abstract: To establish rapid drug sensitivity test kit for vibrio vulnificus. In order to realize the rapid growth of bacteria, 2 kinds of culture media S1 and S2 were designed on the basis of the basic culture medium. Quantitative drug sensitivity test were designed by using one kind of common Vibrio vulnificus as the test strain. This test have 10 kinds of commonly used antibiotics ,each which were 8 drug concentrations.Test kit were made of antibiotics sensitivity 1 and 2, each which contained detection region,growth region and blank control region. The results showed that the culture media S2 had good effect on the growth of Vibrio vulnificus.The drug sensitivity test was carried out with 1×105cfu/mL bacteria liquid,which results were read after 10~12h. The test kit has the characteristics of accurate, simple, rapid and convenient.

Keywords: Vibrio vulnificus, Rapid drug sensitivity test, Bacterial diseases,Kit.

关键词 创伤弧菌,快速药敏试验 ,细菌性疾病,试剂盒

创伤弧菌是引起海水养殖鱼类发病的主要病原菌之一,近年来,随着海水养殖产业化的发展,养殖品种不断的集中及单产量的增加,水质环境恶化,创伤弧菌引起的病害暴发频繁,且养殖者病害防治水平有限或受到经济利益的驱使,出现滥用抗生素的普遍现象[1-4]。为了顺应海水网箱养殖业快速发展的需要,有效减少滥用抗生素,保护水产品质量安全及生态环境,有必要开展病原菌药敏试验的研究。传统的药敏试验方法有K-B纸片法和常量肉汤稀释法等,近年来根据各行业发展的需要,出现了许多新式药敏方法,如多功能显微图象分析系统、应用流式细胞术、氯化三苯四氮唑(TTC)显色法等[5-6]。但这些方法存在检测时间长(57天)、仪器设备精密昂贵、费用高且需要在专业实验室条件下才能进行操作,很难满足条件简陋、技术水平不高的水产养殖基层需要。

目前我国一些水产工作者在“药敏”方面也做了相应研究,如邱军强、李大为、朱越雄等[7-11],但有关创伤弧菌快速药敏试验方法方面的研究末见报道,我们进行了本次研究,旨在于建立一种海水鱼弧菌类病原菌快速药敏试剂盒,为病害防治提供参考。

 

1材料与方法

1.1试验菌株

    创伤弧菌(编号:20131012)由本实验室从患败血病的卵形鲳鲹体内分离获得,并经过16S rDNA鉴定。

1.2主要试剂和耗材

    菌液培养箱为金怡气浴恒温荡器和DNP-9082型电热恒温培养箱;BIO-RAD96孔培养盒购于BIOFILEppendorf移液器;阿尔玛蓝购于上海翊圣生物科技有限公司;海藻糖购于Biotopped;各种药物原粉均由北京某渔药厂惠赠。

1.3药物的配制

根据药物的理化特性及预备实验中的最小杀菌浓度配制母液, 10种抗生素分别为庆大霉素、磺胺嘧啶、林可霉素、链霉素、利福平、新霉素、诺氟沙星、恩诺沙星、氟苯尼考、阿莫西林和强力霉素,母液浓度依次是20020010101052222mg/mL

    海藻糖溶液(1mg/mL)。阿尔玛蓝(刃天青)溶液(0.1%)。以上试剂配制好之后用0 .22μm过滤器过滤,置4℃冰箱保存备用 。

弧菌基础培养基:牛肉膏3g,蛋白胨5g,酵母浸膏1gNaCl5gMgCl4g,加蒸馏水至1000mL。高压灭菌冷却,置4℃冰箱保存备用。

1.4增菌培养基的筛选

为了缩短药敏试验的时间,使创伤弧菌在最短时间内达到药敏所需的浓度,本研究对弧菌基础培养基进行优化,设计成培养基S1和培养基S2。各培养基分别配制100mL/瓶,无菌条下取各配方培养基13支,1mL/支,密封保存,作为检测细菌浓度的空白对照。剩余培养基注入24h培养的创伤弧菌菌液1ml,摇晃均匀,分装13支,5mL/支。然后置于32℃摇床180r/min振荡培养。随后每隔2hBio-RAD 600nm波长下测定菌液OD值,在Excel表中绘制细菌生长曲线。

1.5 指示剂变色时间检测

在无菌条件下,在96孔板的A1F3区依次加入海藻糖10μL,阿尔玛蓝10μL,混合均匀后用60℃干热消毒箱风干,冷却后置于4℃冰箱备用。选用最佳生长的增菌培养基,将培养过夜的创伤弧菌菌液按10-1倍浓度梯度稀释,配成浓度为1×10 81×1071×1061×1051×1041×103cfumL的菌液,依次加入无菌96孔板,每组浓度设3个平行[12]。将密封96孔板置于28℃培养箱中培养,连续观察指示颜色的变化。

1.6药物浓度稀释

药物浓度,参考预实验确定浓度范围,按照2/3倍浓度梯度稀释成8个浓度组。

   1 10种常用药物的8个梯度浓度       μg/mL 

Tab1 8 gradient concentrations of 10 commonly used drugs    μg/mL                     

 

林可霉素Lincomycin

磺胺嘧啶sulfadiazine

庆大霉素gentamicin

链霉素streptomycin

诺氟沙星norfloxacin

新霉素neomycin

利福平rifampicin

恩氟沙星enrofloxacin

氟苯尼考Florfenicol

强力霉素doxycycline

A

200.0

200.0

10.0

10.0

10.0

5.0

2.0

2.0

2.0

2.0

B

133.3

133.3

6.7

6.7

6.7

3.3

1.3

1.3

1.3

1.3

C

88.9

88.9

4.4

4.4

4.4

2.2

0.9

0.9

0.9

0.9

D

59.3

59.3

3.0

3.0

3.0

1.5

0.6

0.6

0.6

0.6

E

39.5

39.5

2.0

2.0

2.0

1.0

0.4

0.4

0.4

0.4

F

26.3

26.3

1.3

1.3

1.3

0.7

0.3

0.3

0.3

0.3

G

17.6

17.6

0.9

0.9

0.9

0.4

0.2

0.2

0.2

0.2

H

11.7

11.7

0.6

0.6

0.6

0.3

0.1

0.1

0.1

0.1

 

1.7指示剂颜色变化判断药物对创伤弧菌的敏感性

药物包埋与风干:依据各种药物特性及用药习惯,将药敏检测96孔板分为:试剂盒1和试剂盒2,试剂盒分为检测区(A1H10列)、生长对照区(A11D12列)、空白对照区(E11H12),每张板分别包被5种药物,双样对照,每种药物8个浓度(图1)。药敏试剂盒加样方法:检测区(A1H10列):海藻糖10uL/孔、各浓度药物10μL/孔、阿尔玛蓝10μL/孔;生长对照区(A11D12列)和空白对照区(E11H12):海藻糖10μL/孔、阿尔玛蓝10μL/孔。混匀后将试剂盒置于60℃干热消毒箱风干,冷却后置于4℃冰箱备用。

菌样检测:用培养基S2配制浓度1×105cfu/mL的创伤弧菌菌液,分别加入风干试剂盒各微孔内,100μL/孔,其中空白对照区加入无菌培养基S2。密封后置28℃培养箱中培养,然后读取数据。

结果判断:根据微孔显示颜色进行判断有无细菌生长,不变色(蓝色)的最低药物浓度作为最低抑菌浓度。当微孔变红色表示该药物浓度不能杀死或不能抑制细菌生长。当生长区变红色和对照区不变色(保持蓝色),为有效检测;当生长区不变色或空白对照区变红色,检测无效,需重新检测。

 


                             

1 10种抗生素对创伤弧菌的药敏测试盒

Pig1 Drug sensitivity test kit of 10 antibiotics to Vibrio vulnificus

1.8根据酶标仪测量判断10种药物对创伤弧菌的敏感性

按照1.7步骤制作的试剂盒1和试剂盒2,但在制作过程中不加入阿尔玛蓝,其余不变。密封后置28℃培养箱培养,24h后用BioTek(酶标仪)600nm波长检测。参照美国临床实验室标准化协会发布,计算细菌存活率的水产细菌药敏检测标准(M49-A),细菌存活率不超过20%的微孔内的最低药物浓度判断为药物最小抑菌浓度[12]

2结果

2.1不同增菌液对创伤细菌的增殖效果

通过测量不同培养基下创伤弧菌的OD值,以OD值的对数值为纵坐标,测量时间为横坐标,在Excel表上绘制细菌生长曲线图。从图2可见,创伤弧菌在3种不同培养基条件下,表现出相似的生长趋势,其中在培养基S2的生长环境中创伤弧菌增长最快,其次是培养基S1和基础培养基,表明在培养基S2的增菌效果最好。因此选用培养基S2作为药敏试验的培养基。

2 不同条件下创伤弧菌的生长曲线

Pig2 Growth curve of Vibrio vulnificus under different conditions

 

2.2指示剂变色时间测定结果

在加入阿尔玛蓝指示剂的不同浓度菌液中,菌液浓度越大,指示剂颜色变红越早,从药物对细菌杀死或抑制作用时间及程度综合考虑[12],使用1×105cfu/mL作为药敏初始浓度,并经过10h生长时间,可进行结果观察与记录。

2 不同生长条件指示剂变化结果

Tab2 The changes of indicators under different growth conditions

菌液浓度/cfu/mL

Bacterium liquid concentration

指示剂变红的时间/h

Time of red indicator

1×103

18

1×104

15

1×105

10

1×106

6

1×107

2

1×108

1

 

2.3根据指示剂颜色判断10种抗生素对创伤弧菌的敏感性

在风干冷藏预备好的96孔板内加入浓度1×105cfu/mL的创伤弧菌菌液,空白对照区加入无菌培养基。在28℃培养箱内经过10h的生长,根据指示剂变红来进行判读各种药物的最小抑菌浓度,林可霉素、磺胺嘧啶、庆大霉素、链霉素、诺氟沙星、新霉素、利福平、恩诺沙星、氟苯尼考、强力霉素10种抗生素的最小抑菌浓度分别是59.3133.33.04.43.01.50.60.40.40.9μg/mL。

2.4根据酶标仪测量OD值及判断10种药物对创伤弧菌的敏感性

通过测定各微孔内各药液培养基的OD值,得到林可霉素、磺胺嘧啶、庆大霉素、链霉素、诺氟沙星、新霉素、利福平、恩诺沙星、氟苯尼考、强力霉素10种抗生素的最小抑菌浓度分别是59.3133.33.04.43.01.50.60.40.40.9μg/mL。可见该结果与根据阿尔玛蓝指示剂判读结果一致。

3.讨论

水产动物是一种免疫能力较低的动物,且生活于水体底部,不易观察,当发现病害时已出现死亡,如再不及时用药治疗,难免造成较大的经济损失。另外随着抗生素类药物的频繁使用,耐药性渐渐在水产动物中出现,造成病情延误或加重的情况时有发生。本研究中,从病原菌的采集到增菌,再到药敏试验,约用20h得到药敏试验结果,比传统的药敏试验方法提前35天。

在药物浓度设计上,本研究参考了预备实验结果、国家规定的水产动物常规用药量[13]设计药物浓度范围,较直观地体现药物对病原菌的敏感性。在药物品种方面,选用10种药物进行初步研究,而水产上常用抗菌类药物还很多,因此今后在药物品种方面加强研究,使试剂盒可检测的药品更加丰富。

本研究中快速药敏试剂盒,到达养殖户手上的产品是经过实验室预包埋药物并风干低温保存的96孔板,对工作环境要求不高,非专业人员可按要求进行操作,并根据指示剂颜色变化判断药物的最小抑菌浓度,体现本测试盒简单、方便特点。

为了提高测试盒的精确性,药物浓度的配制是关键,选择高效且无毒性溶剂也很重要,同时各药液浓度需经过标定,妥善保存,防污染防变质。为了保持药效,在埋药时,本研究采用海藻糖作为包埋剂,在低温条件下进行风干,在进行检测时,试剂盒培养温度2728℃,以防药液蒸发而引起浓度误差。

本试验研究了水产常用药物对创伤弧菌的快速药敏试验,但水产临床并不能及时诊断出创伤弧菌,或需要等待3-5天才能诊断,但水产动物需要及时有效的使用药物以达到较好的防治效果[14-15];因此下步研究工作,直接从鱼体上采集细菌进行增菌,最后进行药敏试验,只需要约20h就能得到试验结果,大大缩短药敏试验时间,为水产动物病害防治争取时间。

 

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