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不同时期金线莲组培苗有效成分含量的比较

时间:2016-10-27来源: 作者: 点击: 130次

施满容1龚林光2

1宁德职业技术学院,福建 福安 355000;2福安质量监督检验所,福建 福安 355000)

要:对福建不同时期金线莲组培苗进行多糖、黄酮、氨基酸、生物碱含量测定,结果表明:组培苗栽培种多糖、氨基酸、黄酮、生物碱含量高于金线莲瓶苗含量;练苗期瓶苗金线莲多糖、氨基酸、黄酮、生物碱含量均表现最低。多糖、总氨基酸含量组培苗栽培种随着栽培时间增加而下降,栽培4个月含量高于6个月含量;总黄酮和总生物碱含量表现随着栽培时间增加而上升,组培栽培6个月含量高于4个月含量。研究结果说明要提高金线莲作为保健品的营养价值或作为中草药的药用价值,金线莲组培苗一定要经过4~6月栽培,以促进有效成分转化,实际应用中可根据具体需要选择不同栽培月龄的金线莲,以更好地利用其使用价值。

关键词:金线莲;组培苗;有效成分;比较

The comparison of effective composition content in the different growth stages of the tissue cultured seedling of Anoectochilus roxburghii

Shi Man-rong1, Gong Lin-guang2

1 Ningde Vocational and Technical College, Fu Jian Fu An 355000

2 Mastery in quality supervision and inspection , Fu Jian Fu An 355000

Abstract: The content of polysaccharide, flavone, amino acids, and alkaloids in different periods of tissue cultured seedling of Fujian Anoectochilus roxburghii was measured in this research. The result shows that: the content of polysaccharide, flavone, amino acids and alkaloids in the tissue cultured seedling of Anoectochilus roxburghii is higher than that in plantlets of Anoectochilus roxburghii. The content of polysaccharide, flavone, amino acids, and alkaloids is lowest in period of the seedling hardening of Anoectochilus roxburghii. With the increasing of the tissue cultured seedling cultivation time, the content of polysaccharide and the total content of amino acids are decreasing, and the content in forth month is higher than that in sixth month. The total content of flavonoids and the total content of alkaloids are both increasing as the cultivation time increases, and the content of tissue cultured seedling in sixth month was higher than that in forth month. The result suggests that to improve the nutritional value of Anoectochilus roxburghii as healthy supplements or medicinal herbs, Anoectochilus roxburghii plantlets must be cultivated for 4 to 6 months to promote the conversion of the active ingredient. In practical application, we can choose different cultivating months of Anoectochilus roxburghii according to specific need to make better use of their value.    

Key words: Anoectochilus roxburghii;Tissue cultured seedling;Effective composition content; Comparison

金线兰(Anoectochilus roxburghii)俗称金线莲,系兰科开唇兰属多年生草本植物,福建省珍稀濒危保护植物。该属植物在我国有20种,2个变种[1]。由于其对生态环境要求严格,加之近年自然环境遭受严重破坏,以及人工过度采挖,野生金线莲越来越少。金线莲在民间使用范围较广,素有“药王”、“金草”、 “神药”、 “乌人参”等美称。研究表明线含有多糖、氨基酸、生物碱、黄酮、微量元素、强心苷类、有机酸、甾体化合物等多种成分[2345]。金线莲在民间常用于治疗肺病、肝炎、肾炎、风湿性关节炎、糖尿病、高血压及神经衰弱,外用可治肿伤、创伤及毒蛇咬伤。近年来,金线莲在治疗高血压、糖尿病及肿瘤方面,日益引起医学界的重视[6]。因此野生金线莲已经不能满足市场的需求,为了保护和利用金线莲这一珍贵药用植物资源,发展金线莲的人工栽培势在必行。随着民间珍稀药用金线莲资源的日趋枯竭,在应用现代组织培养技术加速开发金线莲的同时,也应重视对其体内营养成分和活性成分等方面的探讨,这将有助于拓宽对金线莲组培苗不同时期有效成分的了解,对挖掘金线莲的保健价值和药用价值有着极其深远的意义。本试验对福建不同时期金线莲组培苗,进行了多糖、氨基酸、黄酮、生物碱含量的测定,以期为更好地开发利用和栽培该药材资源提供理论依据。

1  材料与方法

1.1  研究对象。福建金线莲组培4个月瓶苗(简称练苗前瓶苗),福建金线莲练苗半个月瓶苗(简称练苗期瓶苗),福建金线莲组培苗栽培4个月苗、福建金线莲组培苗栽培6个月苗。实验材料经宁德师范学院植物分类学专家陈勇教授鉴定为花叶开唇兰。

1.2  主要仪器。7520型紫外可见分光光度计购自北京普析通用仪器有限公司;EYELA N-1000旋转蒸发仪购自EYELA公司;SHB-III循环水式真空泵购自河南郑州长城科工贸有限公司;EASYpure II超纯水仪购自BarnsTead公司;Sartorius BS 210S 电子天平购自Sartorius公司。

1.3  主要试剂。芦丁、甘氨酸、盐酸麻黄碱标准品购自上海江莱生物科技有限公司;无水葡萄糖、三氯化铝、无水乙醇、苯酚、浓硫酸、柠檬酸、氰化钾、乙二醇甲醚、茚三酮等均为分析纯,市售。

1.4  多糖含量的测定

1.4.1  标准曲线的制作精确称取葡萄糖标准品溶液,分别置于试管中,加蒸馏水至1.0mL,加入2.0%的苯酚溶液1.0 mL,浓硫酸5.0 mL,混匀,沸水浴加热 2 min,取出冷却至室温,在490 nm 波长处测定吸光度。以吸光度为横坐标,葡萄糖浓度(mg/ml)为纵坐标绘制标准曲线。

1.4.2  样品液的制备。精确称取500 mg金线莲干粉,置于25 mL容量瓶中,加水至刻度,于80℃水浴加热90 min,取出冷却至室温,提取液摇匀后过滤。滤液中加入50.0 mL无水乙醇,6000 r/min离心,弃上清液,沉淀用90%的乙醇洗涤2次,6000 r/min离心,弃上清液,沉淀加水溶解,定容至25 mL,即得样品液。                             

1.4.3  样品多糖含量的测定。精确吸取经稀释一定倍数的样品液0.2 mL ,按1.4.1 中的显色方法测定吸光度,以葡萄糖为标准品计算金线莲中多糖含量。

1.5  总氨基酸含量的测定

1.5.1  标准曲线的制作。以甘氨酸为标准品,取标准氨基酸母液将其稀释成一定浓度,取不同浓度标准氨基酸溶液1 mL,加 0.2 mol/L柠檬酸缓冲溶液(PH5.0)1 mL,充分混和,加入1 mLKCN-乙二醇甲醚-茚三酮溶液,充分混匀后在100℃沸水浴中加热15 min,取出立即加入3 mL60%乙醇稀释。冷却后,选择波长570 nm进行比色,以吸光度为横坐标,氨基酸浓度(mg/mL )为纵坐标作标准曲线。                

1.5.2  样品液制备。精确称取500 mg干粉,置于研钵中加少量80%乙醇,研磨成匀浆,移于25ml容量瓶中,用乙醇将残渣洗入瓶中,最后定容至刻度。过滤,在室温下减压蒸发干燥,蒸发的最后阶段在表面皿上进行,得到固形物。使用前用蒸馏水溶解,定容至25 mL,即得样品液。

1.5.3  样品总氨基酸含量的测定。精确吸取经稀释一定倍数的样品液 1 mL,按1.5.1中的显色方法测定吸光度,以氨基酸为标准品计算金线莲中总氨基酸含量。

1.6  总黄酮含量的测定

1.6.1  标准曲线的制作。采用三氯化铝显色法测定,以芦丁为标准品,精密称取芦丁标准品4.0 mg,用乙醇溶解后定容至10 mL,配成0.4 mg/mL的标准溶液。吸取标准溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL分别至10 mL容量瓶中,用乙醇定容至刻度,摇匀。分别取1 mL上述芦丁标准溶液稀释液于10 mL干净试管中,加入1%三氯化铝溶液0.5 mL以及30%乙醇2.0 mL,振荡摇匀,静置反应15 min后在420 nm波长下测定吸光度值,以吸光度为横坐标,卢丁浓度(mg/mL)为纵坐标制作标准曲线。

1.6.2  样品液制备。精确称取500 mg干粉,置于锥形瓶中,加无水乙醇25 mL,超声处理(功率350 W,频率50 kHz,温度60℃)2 h,滤纸过滤,定容至25 mL,即得金线莲样品溶液。

1.6.3  样品黄酮含量的测定。精确吸取样品液1.0 mL,按1.6.1 中的显色方法测定吸光度,以芦丁为标准品计算金线莲的总黄酮含量。

1.7  总生物碱含量的测定

1.7.1  标准曲线的制作。取盐酸麻黄碱对照品母液将其稀释成一定浓度,取不同浓度标准盐酸麻黄碱溶液1 mL,再精确加入5 mL pH 5.4柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液, 1 mL0.1%溴麝香草酚蓝溶液,氯仿10 mL,振摇混匀待用.在波长418 nm进行比色,以吸光度为横坐标,盐酸麻黄碱浓度(mg/mL)为纵坐标作标准曲线。

1.7.2  样品液制备。精确称取500 mg干粉,于锥形瓶中用50 mLpH3的酸性水溶液在功率为70 w、温度为60℃的超声条件下提取1 h,提取2次,合并提取液;提取液用氨水调节pH至10,于分液漏斗中用25 mL氯仿萃取,氯仿萃取液即为样品液。

1.7.3  样品生物碱含量的测定。精确吸取样品液1 mL,按1.7.1 中的显色方法测定吸光度,以盐酸麻黄碱为标准品计算金线莲的生物碱含量。

2   结果与分析

2.1  多糖、总氨基酸、总黄酮、总生物碱回归方程

以葡萄糖、甘氨酸、芦丁、盐酸麻黄碱为标准品,通过分光光度法分析分别得到葡萄糖、氨基酸、芦丁、盐酸麻黄碱含量的标准曲线(图1)以及金线莲多糖、氨基酸、黄酮、生物碱含量测定的回归方程分别为: Y=0.0683X+0.0038(R2=0.9998)、Y=0.0957X+0.0046(R2=0.9996)、Y=0.1015X+0.0092(R2=0.9996)、Y=0.1137x-0.0200(R2=0.9997)。

    

  

1葡萄糖、氨基酸、芦丁、盐酸麻黄碱标准曲线

Figure 1 The standard curve of glucoseamino acidrutinephedrine  hydrochloride

2.2不同时期金线莲组培苗多糖含量的比较

不同时期金线莲多糖含量测定结果见图2,由图2可知:4种不同时期金线莲组培苗多糖含量在7.04%~10.70%之间,组培苗栽培4个月多糖含量最高,高于栽培6个月多糖含量,练苗期组培瓶苗多糖含量最低。方差分析表明:栽培4个月多糖含量与其他3种相比较达到了极显著差异水平,栽培6个月多糖含量与练苗期组培瓶苗比较也达到了极显著差异水平。这可能是因为处于练苗期的瓶苗,移出培养室后,生长环境的光、温、湿度等剧烈变化,植物处于逆境生长环境中,代谢速率增加,瓶苗主要靠先期积累的养分进行生理代谢的维持,而多糖作为植物的主要能量储备来源,此时大量消耗,导致瓶苗金线莲多糖含量呈现下降趋势。通过4 个月、6个月的移栽适应,两个栽培月龄的金线莲多糖开始出现增长,表明此时金线莲已适应新的生长环境,自身光合作用的累积大于代谢消耗。4个月栽培苗多糖含量高于6个月栽培苗,可能是由于6个月栽培苗多糖已参与其他物质的代谢过程,故含量有所下降。

          

                    2 不同时期金线莲组培苗多糖含量

注:不同大、小写字母分别表示差异极显著(P<0.01)或差异显著(P<0.05),下同。

2.3不同时期金线莲组培苗总氨基酸含量的比较

不同时期金线莲氨基酸含量测定结果见图3,图3表明:不同时期金线莲组培苗总氨基酸含量在4.09%6.10%之间,栽培种氨基酸含量高于瓶苗,练苗前瓶苗总氨基酸含量4.20%高于练苗期瓶苗4.09%,组培苗栽培4个月总氨基酸含量为6.10%高于6个月栽培种4.34%。方差分析结果表明:栽培4个月氨基酸含量与其他3种相比较达到了极显著差异水平,另外3种氨基酸含量差异不显著。这可能是由于处于练苗期的瓶苗,移出培养室后,生长环境的光、温、湿度等不再恒定不变,植物处于逆境生长环境中,导致瓶苗金线莲氨基酸含量呈现下降趋势。通过4 个月、6个月的移栽适应,两个栽培月龄的金线莲氨基酸开始出现增长,表明此时金线莲已适应新的生长环境,自身物质代谢的累积大于代谢消耗。随着栽培时间延长,氨基酸可能重新参与了其他物质的代谢过程,故表现出6个月栽培种氨基酸含量小于4个月栽培种而且差异达到了极显著水平。

 

 

3 不同时期金线莲组培苗总氨基酸含量

2.4 不同时期金线莲组培苗总黄酮含量的比较   

4表明:不同时期金线莲组培苗总黄酮含量在0.39%0.67%之间,瓶苗的总黄酮含量均低于栽培苗,练苗期瓶苗总黄酮含量最低为0.39%,组培苗栽培6个月总黄酮含量最高为0.67%。方差分析结果表明:栽培6个月总黄酮含量与其他3种相比较达到了极显著差异水平,栽培4个月总黄酮含量虽有提高但与瓶苗比较无显著差异水平。这可能是由于随着栽培时间的延长,组培苗中积累的多糖、氨基酸参与了次级代谢物质的合成过程,促进了栽培苗内黄酮的积累,因而表现出组培苗栽培6个月总黄酮含量高于其他3种组培苗同时差异达到了极显著水平,4个月栽培苗黄酮含量虽有提高但与瓶苗比较还达不到显著差异水平。

 

4 不同时期金线莲组培苗总黄酮含量

2.5不同时期金线莲组培苗总生物碱含量的比较

5表明:不同时期金线莲组培苗总生物碱含量在0.0330.066%之间,瓶苗总生物碱含量低于组培苗栽培种,练苗期瓶苗生物碱含量低于练苗前瓶苗,栽培4个月总生物碱含量低于6个月栽培种,其中练苗期瓶苗生物碱含量最低为0.033%,组培苗栽培6个月总生物碱含量最高为0.066%。方差分析结果表明:栽培6个月生物碱含量与其他3种相比较达到了极显著差异水平,栽培4个月生物碱含量虽有提高但与瓶苗比较无显著差异水平。这可能是由于随着栽培时间延长,组培苗内积累的营养物质参与了次生物质代谢过程,有利于生物碱的合成,因而表现出生物碱含量随着栽培时间延长而增加,组培苗栽培6个月生物碱含量高于4个月栽培种并且差异达到了显著差异水平,4个月栽培苗生物碱含量虽有提高但与瓶苗比较还达不到显著差异水平。

   

                        5 不同时期金线莲组培苗总生物碱含量

3 结论与讨论  

对福建不同时期金线莲组培苗进行多糖、氨基酸、黄酮、生物碱含量的测定,结果表明,氨基酸、黄酮、生物碱含量均表现为组培苗栽培种含量高于瓶苗含量,练苗期瓶苗多糖、氨基酸、黄酮、生物碱含量均表现最低。多糖、总氨基酸含量组培苗栽培种随着栽培时间增加而下降;总黄酮和总生物碱含量随着栽培时间增加而上升。多糖含量随栽培时间增加而下降,总黄酮含量随栽培时间增加而上升,这结果与黄瑞平等[7]测定结果一致。其原因可能是因为金线莲在组织培养过程中,培养基营养丰富,植物的合成代谢较旺盛,多糖和氨基酸作为植物营养物质在体内持续积累,金线莲移入栽培基质后,原积累的多糖和氨基酸参与物质代谢过程,故随着栽培时间延长含量降低。黄酮和生物碱作为植物次生代谢产物,可能在一定环境条件下会增加其合成量,所以,金线莲黄酮和生物碱含量随着栽培时间的增加而增加。多糖、氨基酸、黄酮、生物碱是金线莲的主要有效成分,也是金线莲产品质量标准的重要依据,其含量的多少将直接影响金线莲及其相关产品的应用功效。

多糖含量栽培4个月最高,达到10.70%,比黄瑞平等[7] 人研究的福建4月龄都高,较王常青等[8]报道的从台湾金线莲试管苗中测得水溶性多糖含量11.1%稍低,比赵保发等[9]用水提法从金线莲干草中提取的最高多糖含量(8.23%)高30%4个样品黄酮含量测定结果比黄瑞平等[7]和龚秀会[10]等研究稍低,但与文献报道的野生金线莲( 0.4%) 含量相当或略高[11]。生物碱也是金线莲的活性成分之一,本研究中,总生物碱的积累,以栽培6个月组培苗最高,达到0.066%,与林丽清等[12]报道的金线莲干草中最高含量0.05296%24.5%,是最低含量0.03320%的近2倍。

测定结果表明,福建组培苗栽培4~6月,多糖、总黄酮、总氨基酸、总生物碱含量均高于瓶苗,要提高金线莲作为保健品的营养价值或作为中草药的药用价值,金线莲组培苗一定要经过4~6月栽培,以促进有效成分转化。栽培4个月和栽培6个月多糖、氨基酸、黄酮、生物碱含量有差异,实际应用中可根据具体需要选择不同栽培月龄的金线莲,以更好地利用其使用价值,本研究结果对大量发展金线莲产业具有一定指导意义。

 

参考文献

[1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物(第十三卷)[M].青岛:青岛出版社,2002.

 [2] 何春年,王春兰,郭顺星,等.福建金线莲的化学成分研究Ⅱ[J].中国中药杂志,2005(10):761763

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[6] 唐健,邓元荣,卓仪荣. 金线莲的药理活性研究进展[J]. 海峡药学, 2008,20(12): 77—79.

 [7] 黄瑞平,黄颖桢,陈菁瑛,赵云青. 不同月龄金线莲多糖和总黄酮含量的比较[J]. 热带生物学报, 2012,3(2): 174—176.

[8] 王常青,严成其,王勇,.台湾金线莲多糖的分离纯化及其体外抑瘤活性研究[J].中国生化药物杂志,2008,29(2):9396.

[9] 赵保发,张志信.金线莲多糖提取工艺的研究[J].云南师范大学学报,2008,28(4):6063.

[10] 龚秀会,许 敏,董鸿竹,等.不同基原金线莲植物的化学成分比较研究[J].安微农业科学,20124036):175301753117607.

 [11] 张志信,张铁,赵保发,等.文山野生金线莲总黄酮及多糖含量测定[J].时珍国医国药,200920(6) :13621364

[12] 林丽清,黄丽英,张亚锋,.金线莲总生物碱的提取方法及条件的优化[J].中药材,2006,29(12): 13651366.

 

 

 

 

 

 

 

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