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长臀鮠精液保藏研究进展

时间:2016-11-28来源: 作者: 点击: 84次

             姜文钊,王桢璐,谢少林,王超,叶鞘,邹记兴

           (华南农业大学 动物科学学院,广东 广州 510642

 

摘要:【目的】长臀鮠为中国南部特有属种,由于其经济价值极高并且肉味鲜美,原为珠江深受欢迎的主要食用鱼类之一。但是随着人口剧增,致使资源量明显减少,并且长臀鮠亲鱼雌雄成熟不同步,严重影响长臀鮠的人工授精。因此有必要总结近几年精子保藏取得的进展。【方法】通过查阅相关的文献,并结合笔者的研究,归纳总结出了精子保藏方面的最新研究进展。【结果和结论】精子在保藏过程中收到多重因素的影响。包括精子内部生理生化的反应以及外界环境的影响,比如温度、冷冻剂、渗透压、降温速率以及外界离子等等。因此建立一套完整的精子保藏系统要综合各种因素的影响,找到各种因素的最佳搭配组合,并且结合最新保藏技术与设备,获得精子保藏的最佳效果。

关键词:性成熟不同步  精子保藏  多重因素  最佳搭配

基金项目:广东省海洋渔业科技与产业发展专项科技攻关与研发项目(A201501A02);广东省科技计划项目(2015A020209126


 Research progress in semen preservation of Cranoglanis bouderius

              

      Jiang Wenzhao , Wang Zhenlu , Xie Shaolin ,Wang Chao, Ye Qiao,Zou Jixing

  (College of Animal Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642,China)


AbstractObjectiveCranoglanis bouderius is endemic species in southern China distributing in fresh water.Due to its high economic value and delicious taste,it is one of the most popular food fish in the pearl river formerly.But with the population becoming more and more large,the resource decreased significantly.Moreover,mature male and female are non-synchronous of sexual maturity,which has a serious influence on artificial breeding.Therefore,it is necessary to summarize sperm preservation progress in recent years.MethodsThe progress of semen preservation was summarized through the relevant literatures and the authors researchers.Results and conclusionThe sperm receives the influence of multiple factors in the process of preservation, including sperm internal physiological and biochemical reaction and the influence of the external environment, such as temperature, coolant, osmotic pressure, cooling rate and external ion and so on. Therefore, to establish a complete set of sperm preservation system needs to take every factor into consideration, in which case we should find out the best combinations of various factors and combine the latest preservation technology and equipment to obtain the best effect of sperm preservation .

Key words: non-synchronous of Sexual maturity  sperm preservation  multiple factors  best combinations

1. 前言

    长臀鮠为亚热带山麓河溪底层鱼类,属鲇形目,长臀鮠科,长臀鮠属系珠江水系特产鱼类。因为其经济价值极高,肉质鲜美,深受人们喜爱[1,2,3]。近几年由于人口剧增,滥捕滥杀严重,已被我国列入濒危物种之列[4]。因此进行人工繁殖显得尤为重要,但是由于亲鱼雌雄性成熟不同步,建立一套完整的精子保藏系统显得尤为重要[5,6,7].近年来,大量学者纷纷展开了对长臀鮠的相关研究,主要集中在人工育种[8].,形态和结构特征研究[9].,饲料营养及消化等方面[10]随着鱼类养殖业的迅速发展以及杂交育种、优良品种的选育等技术的发展,鱼类精液保存技术也越来越广泛,常见的有常温保藏、冷藏保藏、冷冻保藏[11]。将精子放在常温等渗条件下,目的是减少精子用来调节渗透压平衡的能量消耗而延长精子的寿命。在人工授精操作过程中,用生理盐水代替淡水,可提高受精率 冷藏保存是将鱼类精子放置于冰箱的冷藏室,方法可保存精液达数天至数十天之久配以合适的稀释液以及冷冻温度,保存时间将会更长。冷藏保存时精子有微弱的代谢,因此需要消耗氧气,在保存时应保持充足的氧气。 常温保存和冷藏保存经常用于短期精液保存但是冷冻超低温冷冻可以长期保存精液。常用的制冷剂有干冰和液氮等。精子处于超低温情况,其代谢会停滞,精子处于假死状态。精子保藏活力不仅是评价精子质量的重要指标,也是进行人工繁殖的基础,不同的保藏条件对于保藏后精子的活力影响显著。本文仅就近20年关于精子活力方面的研究热点以及对精子保藏活力效果研究作一综述,希望能为其人工育种方向提供依据和理论指导。

 

2. 精子的获取

精子的产生历经精原细胞,初级精母细胞,次级精母细胞,精子细胞爆发性增殖,充盈于收集小管,并且自体精子与异体精子储存场所大不相同.研究发现繁殖期石磺个体符合“性别分配理论”的观点,在第一次交配完成后会发生雌雄功能转变的交配(S1*L2)4,受精囊的重量与交配时间存在非常显著的负相关关系,而充当雄性功能的个体重和交配时间呈极显著地正相关[12]。颜跃弟[13]等首次用胰蛋白酶消化日本沼虾精荚,获得了游离得沼虾精子,并经过台酚蓝染色,以每克精荚所获得形态正常,结构完整且不被染色的存活的精子数为依据,探究胰蛋白酶处理最佳条件。陈金涛[14]等利用Percoll不连续梯度,在角转头离心机中对长臀鮠精液进行分离,设置不同的梯度和离心时间,最后用PBS重悬浮,此方法能保证精子纯度和膜完整性。


3. 精子活力判断

对于精子活力的检测主要有染色观察法和计算机辅助细胞活力分析仪两种,前者方法比较简单,往往需要目测结果,相对误差较大。后者通过跟踪精子活动轨迹,测量精子活动速率能准确测得精子活力,但是测量价格高,相信在未来一定会有很好的应用前景。宾乘勇[15]等为筛选出适宜于马氏珠母贝pinctada mattensii 精子形态分析的染色方法,分别采用曙红Y和结晶紫染液对其精液抹片进行染色,通过电镜观察发现这两种染色方法均可达到预期效果,适用于马氏珠母贝精子活力评价。朱冬发等[16]在对三疣梭子蟹精子活力分析时,曙红B染色法和钙载体A23178诱导精子顶体反应法的活力测定结果和样品的理论值呈现正相关关系,二者均可作为其活力检测。于菲菲[17]等人利用显微镜直接观察与曙红Y相结合方式,成功探索出一套适用于栉江珧和近江牡蛎精子冷冻保存的技术方案。不同的染色方法会使精子不同部位显示不同的染色效果,因此在测定精子活力的时候要根据不同物种使用不同的染色方法,这样才能达到最佳的染色效果。

4 影响精子保藏活力的因素

鱼类精子活力是精液质量的一个重要指标,更是精液低温保藏、人工授精等繁殖生物学研究的基础。精子保藏后的活力与保藏时的盐度、PH、温度、渗透压、离子浓度、激素及季节变化等因素密切相关,这也是鱼类精子生理特性和环境相适应的结果。

4.1温度对精子保藏活力的影响

区又君[8]在研究不同盐度和温度对七带石斑鱼低温保藏精子活力时发现,七带石斑鱼精子活力最强时盐度为30,最适温度为22.8℃,精子活力与盐度和温度均为二次函数关系,并且15以下的低盐度水喝淡水对其精子活力具有可逆的抑制作用。刘鉴毅[9]在对篮子鱼精子活力研究时发现,随着盐度的升高,篮子鱼精子活力会呈现先升高后降低的趋势,究其原因可能是高温破坏了精子体内酶的活性,进而影响到精子活力。

4.2冷冻保护剂对精子活力的影响

通过用单细胞凝胶电泳检测大黄鱼精子DNA完整性,并通过计算彗星速率与系数、分析彗星图像来分析不同浓度DMSO对保藏的精子DNA稳定性作用大小,研究发现高浓度的DMSO对精子DNA具有明显的损害作用,冷冻保护剂的毒力大小是影响DNA稳定性的主要因素[20]。金春华[21]在对黄姑鱼精子超低温冷冻机细胞结构损伤的机制进行检测,运用SCGE技术检测DNA损伤,荧光双染色流式细胞仪技术(FCM)检测细胞膜的完整性,结果发现,冷冻后的DNA损伤程度与作为冷冻剂的DMSO质量分数呈正相关,较高质量分数的DMSO是引起黄姑鱼精子活力下降和膜结构破坏的主要原因。

4.3渗透压对精子活力的影响

渗透压也会对精子活力产生影响[22],低渗透压会对多齿任式鳉(Jenynisia multidentata)精子产生破坏作用,高渗透压会减少精子运动能力,并对精子细胞膜和DNA稳定性造成损害,但是可以用于保存精子能量,在人工授精过程中发挥着巨大的作用。

4.4冷冻速率对精子活力的影响

在对条纹鲈鱼精子保藏活力研究时,T.E Frankel[23]发现,不同的精子冷冻时的速率也会影响冷冻后精子的活力,通过测量ATP含量、精子细胞膜完整性,并且利用CER0S 电脑辅助精子分析系统检测精子活力,当冷冻速率为-40℃/min时,条纹鲈鱼的的精子活力最佳。

4.5离子对精子活力的影响

钙稳态对于维持精子活力也是必不可少的,对于保持精子活力与功能起的至关重要的作用,无论使用SBE还是T350储存精子,钙稳态都会发生破坏,钙泵就不会在最适条件下工作,条纹鲈鱼的精子活力就会降低[24]。张金平[25]在对神农架多鳞铲颌鱼精子活力观察时发现,精子在河水中活力较高,,平均快速运动时间为33.2s,平均寿命为69.5s,当氯化钠浓度为0.5%时,精子活力最好。

5 关于精子活力保藏及育种新方法                                  

    在对黄脂鲤精子活力研究时发现,当雄鱼用鲤鱼脑垂体注射与只注射0.9%盐水相比,产生的精子活力会增强。同时将雄鱼与在排卵期的雌鱼一同培养也会增强雄鱼精子的活力[26]。相反,抗生素和氧气的增加会减少精子的运动能力。Goro Yoshizaki[27]在最近的精原细胞研究中发明了一种通过移植精原细胞到受体鱼来产生有功能性精子或卵子的方法,通过低温储存与精原移植相结合的方法产生有功能性产物,从而对濒危物种的保护起到关键性作用。最近对鲤鱼研究发现,在保存夜里加入蜂胶后检测冷冻保藏后精子DNA完整性与活力,均比对照组(不加蜂胶)的效果好,且最佳浓度为0.8mg/ml,充分说明蜂胶在精子冷藏中也起到了至关重要的作用[28]。在测量以卵磷脂与蛋黄作为冷冻保护剂精子保藏效果时,Cengiz Yildiz[29]等人发现,卵磷脂不仅作为细胞膜的重要组成部分,作为保护剂同样对低温保藏精子的活力起到保护作用,并且体积为保护剂10%时能最大程度上保持精子的活力,因此用大豆卵磷脂作为冷等保护剂必将有巨大的发展潜力。目前最新对于DNA完整性的检测方法主要有原位末端标记法与彗星实验方法,结合计算机辅助精子分析仪来检测精子能动性,利用PI/SYBR-14和荧光显微镜检测精子的生存能力,结果准确度均比较高[30]

 

 

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