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扇贝多糖提取的工艺优化及其抗氧化活性研究

时间:2016-03-03来源: 作者: 点击: 245次

宋照风,赵海全

(佛山科学技术学院 广东 佛山 528000

摘要:本文采用正交试验法对扇贝多糖的提取工艺进行优化,以超声波酶解法为提取工艺,以扇贝多糖的提取率为指标,研究了加酶量、水浴酶解温度、原始料液比和超声波时间对提取效果的影响。在超声波酶解法中,最优的提取条件为:加酶量为2.75%,水浴酶解温度为55℃,原始料液比为1:35和超声波时间为1.75h。同时研究了扇贝多糖的抗氧化性,扇贝多糖在0.6~0.8g/L浓度范围内,对·OH的清除作用明显,抗氧化性更佳。扇贝多糖具有抗病毒、抗肿瘤及抗免疫性等功效,可以推广应用于医药行业,对人类的健康发展有着重要的影响。

关键词:酶解法;扇贝多糖;提取条件;抗氧化性

Scallops polysaccharide extraction technology was optimized and antioxidant activity of scallops polysaccharides was studied

SONG Zhao-feng  ZHAO Hai-quan

(Foshan University, Foshan Guangdong,528000

Abstract:In this paper, orthogonal test scallops polysaccharides extraction process optimization, ultrasonic enzymatic method for the extraction process to extract polysaccharides scallops rate indicators studied enzyme dosage, reaction temperature water bath, the original solid-liquid ratio and ultrasonic time on the extraction effect.In ultrasonic enzymatic method, the optimal extraction conditions: enzyme dosage was 2.75%, reaction temperature water bath was55 ℃, the original solid-liquid ratio of 1:35 and ultrasonic time of 1.75h. Also studied the antioxidant activity of polysaccharides scallops, scallops polysaccharide in 0.6 ~0.8g/ L concentration range, clear the role of ·OH obvious, better oxidation resistance. Scallops polysaccharide with anti-virus, anti-tumor and anti-autoimmune and other effects that can be applied to the pharmaceutical industry to promote the healthy development of mankind has an important impact.

Key words: enzymatic method;scallops polysaccharides;extraction conditions;antioxidant

1.前言

扇贝鲜甜美味,营养成分丰富,是海味中的三大珍品之一。其含有大量牛磺酸、胆碱、多糖、维生素E、酚酶和核黄素等具有药用价值的营养物质,经济价值较高[1,2]。在扇贝中提取出的胆碱是一种强有机碱,可以提高记忆力,预防心血管疾病和防止肝硬化等作用[3]。扇贝中的发酵素具备健脑、明目、健脾和胃、润肠、美容保健、通血和抑癌抗瘤等优良的治疗价值。

文献有报道扇贝中的蛋白和牛磺酸的提取工艺研究,但是扇贝中多糖提取的工艺研究较少[4,5]。多糖(polysaccharide)是由糖苷键连接而成的糖链,起码要由10个以上的单糖构成的聚合糖高分子碳水化合物。多糖的基本单位单糖,多糖相对分子质量从几万到几千万。多糖在自然界分布极广,不仅存在于植物中,还存在于动物体内。

多糖通常具备免疫调节、抗病毒、抗癌、降血糖、乳化、保湿、抗氧化等功效。根据朱涛等人的研究发现,贝类多糖具备抗病毒、加强免疫功能及抗肿瘤的活性[6]。赵芙钗在海湾扇贝生殖腺多糖和栉孔扇贝生殖腺多糖进行动物免疫试验研究中发现,该多糖能提高小鼠的[1]脾脏指数和胸腺指数、迟发型变态反应、腹腔巨噬细胞的吞噬能力、血清溶血素水准[7]。范巧云等在扇贝多糖进行抗鸭乙肝病毒研究中发现,扇贝多糖在300mg/kg剂量组合10d时抗鸭乙肝病毒效果最好[8]。由于扇贝多糖是一种纯天然产物,若作为药物,其毒副作用少、活性强,对人类的医药界有着深远的意义。多糖中的羧基、羟基和其余急性基团能与水分子构成氢键而结合大量的水分,同时多糖分子链相互交织成网状,能够与水的氢键相结合,起到优良的保水功效。多糖具备杰出的成膜功能,能够在皮肤表面上构成一层匀称的薄膜,有效缩少皮肤表面的水分挥发,是水分逐步渗透到角质层,滋养角质层,保留皮肤本身的水分,从而达到多糖保湿的效果。邓一清在翡翠贻贝多糖的保湿研究中发现,贝类多糖具有良好的保湿效果,可以制成多糖护肤化妆水[9]

当前多糖的常用提取方法主要有:酸提法、碱提法、水提法和酶提法。在酸碱条件下,多糖的糖苷键容易发生断裂,从而导致多糖的立体结构发生改变,影响其生物活性[10]。热水浸提法是最为常用的多糖提取方法,有利于将来产业化生产,但是消耗时间和能量较多,效率低下酶解法一般是和热水浸提相结合的,该方法具备试验条件温和、杂质易除和高效率等益处。动物多糖由于蛋白质含量高,因此会先将蛋白质酶解处理,再提取多糖。超声波具有能量和波动的双重属性。超声波可以在液体介质中释放能量,其表现为气泡的形成与破裂。介质和容器吸收声之后产生共振,引起二级效应,促进化学反应。

动物多糖和微生物细胞内多糖的组织通常都有脂质包围。因此,在提取扇贝多糖之前,需要进行脱脂处理,有利于提高扇贝多糖的提取率。近年来,有的研究加入超声波辅助脱脂,脱脂效果更佳。溶液萃取法是通过使用一些有机溶剂和油脂互溶从而达到脱脂的效果。由于溶液萃取法对多糖的损耗相对较少、操作简单方便,而且部分有机溶剂还可以起到去色素和单糖的效果[11]。因此,采用丙酮和无水乙醇、石油醚洗涤样品的脱脂方式更有利于多糖的提取[12]

扇贝属于高蛋白动物,因此除蛋白在提取扇贝多糖工艺中起到重要的影响[13]。动物多糖通常与蛋白质相连,提取多糖的过程中需要在多糖不被明显降解的条件下除去蛋白质[14]。蛋白质酶解后,可以使多糖与蛋白质结合的糖苷键断裂,除去蛋白质。然后用sevage法除去游离的蛋白质,增加多糖的溶解度。

本文通过对扇贝进行脱脂、除蛋白、去色素等步骤进行提取粗多糖。使用苯酚-硫酸法进行多糖含量测定,因而测得扇贝多糖提取率。在单因素试验和正交试验的实验结果中,通过对比扇贝多糖提取率,挑选出最优的提取扇贝多糖实验条件。使用斐林试剂鉴定扇贝多糖是否具有还原性。最终,测定扇贝多糖对羟基自由基体系的作用,得出其抗氧化性的最佳浓度。通过本研究可以提高扇贝的加工价值,提高扇贝的利用率,改造扇贝的加工产业链。扇贝多糖在保湿、抗病毒、抗肿瘤和增强免疫力都已经有所报道,但是其抗氧化性暂时未见报道。

2 材料和方法

2.1 主要实验试剂及仪器

扇贝(市购),无水乙醇,氯仿,硫酸,苯酚,葡萄糖,木瓜蛋白酶,TKD-1006A单槽式超声波清洗机,KA-1000 低速台式离心机,85-2控温磁力搅拌器,722可见分光光度计等

2.2 实验步骤

实验流程如下:样品除壳→粉碎 →脱脂→洗涤→离心取沉淀→脱脂泥→超声加酶热水解→灭酶→离心取上清液→浓缩→去蛋白→离心取清液→醇沉浓缩→洗涤→烘干称量。

实验步骤:

1、样品预处理。去除扇贝外壳和黑色的扇贝软体组织。用清水清洗干净扇贝,称取275g扇贝,用剪刀剪成小碎块,放入捣碎机中,加入50g蒸馏水,捣碎2分钟成匀浆即可。将匀浆平均分成25份。给每个烧杯做好标签,编号为:123……25。编号1-16号做单因素实验,编号17-25号做正交因素实验。

2、脱脂处理。匀浆分别使用30ml 丙酮和无水乙醇洗涤3次,每次均离心取沉淀(2000rpm,10min)。再使用30ml 石油醚洗涤一次沉淀,离心取沉淀(2000rpm,10min)。

3、多糖提取。往沉淀中加入适量水。(若原始液料比为:1:40,则加入440ml蒸馏水)。预热至相应的温度,加入适量木瓜蛋白酶(若加酶量未2.0%,则加入0.22g木瓜蛋白酶)。将烧杯放入恒温超声波仪中,超声波持续相应的时间。结束超声波后,95℃水浴灭酶15分钟,冷却后离心(2000rpm,10min),取上清液。

4、除蛋白。将混合液放在80℃的恒温水浴锅中,浓缩混合液至100ml。浓缩后,加入20ml 三氯甲烷和5ml 正丁醇,使用磁力搅拌器持续搅拌30min。倒入分液漏斗静置20min。分层后,除去下层的有机溶剂(中间白色层为蛋白质)。为了更好地清除蛋白质,需离心取上清液(2000rpm,10min)。

5、醇沉浓缩。将上清液放置在温度为80℃的恒温水浴锅中,浓缩混合液至50ml。冷却后,加入150ml无水乙醇,在冰箱4℃醇沉过夜。过夜后,将上层溶液用吸管除去,将剩下混合液放在蒸发皿上蒸发至糖浆浓稠状态后,放在50℃的恒温烘箱中烘10小时。烘干后,将扇贝多糖研磨成颗粒状,使用电子天平称重,并测定扇贝多糖的含量。

2.3 扇贝多糖含量测定

    本文选用苯酚-硫酸法测定扇贝多糖含量。其原理为:在硫酸的作用下,多糖先水解成单糖,并迅速脱水生成糖醛衍生物,然后与苯酚生成橙黄色化合物。最后通过测定吸光度,推算出扇贝多糖的含量。该方法简易、高效、灵敏度高、重复性好,对每一种多糖只制作一条标准曲线,颜色持久。

2.3.1 制作标准曲线

精密称取0.0100g葡萄糖于小烧杯中,加入少量蒸馏水用玻璃棒溶解后,将溶液转至100ml容量瓶,添加蒸馏水稀释至刻度处。使用吸量管分别往试管加入00.40.60.81.01.21.41.61.8ml葡萄糖标准溶液,均增加蒸馏水至2.0ml,精确加入6.0%苯酚溶液1.0ml,摇匀后加入浓硫酸5.0ml,摇匀静置5分钟,再沸水浴15分钟。冷却后在490nm处测定各溶液的吸光度。以吸光度为横坐标,以样品液的浓度为纵坐标,绘制标准曲线。

葡萄糖的标准曲线数据

样品液体积(ml)    0      0.2

 0.4     0.6      0.8       1.0

浓度(mg/ml)       0      0.1  

吸光度          0.299   0.389   

 0.2     0.3      0.4       0.5 

0.499   0.621    0.723     0.843

由图1可知,0.1 mg/mL~0.5 mg/mL范围内葡萄糖质量浓度与吸光度呈现出良好的线性关系。C=0.28776+1.09829*AR2=0.9971    A-吸光度,C-浓度(mg/ml

2.3.2 扇贝多糖含量的测定

精密称取0.0100g扇贝多糖样品(干燥)于小烧杯中,加入少许蒸馏水溶解后,将溶液转至100ml容量瓶,增加蒸馏水稀释至刻度。使用吸量管精确往试管加入1.0ml葡萄糖标准溶液,均补充蒸馏水至2.0ml,精确加入6.0%苯酚溶液1.0ml,摇匀后加入浓硫酸5.0ml,摇匀静置5分钟,再沸水浴15分钟。冷却后在490nm处测定各溶液的吸光度。根据回归方程求出多糖浓度,之后求得多糖的含量。

多糖提取率=×100%                       2-1

                            多糖含量=×100%                        2-2

 

其中: M2—扇贝软体组织的质量(gM1—提取出的粗多糖的质量(g

C —提取液的浓度(g/ml        F —换算因子

D —提取液的稀释倍数              M3—扇贝多糖样品的质量

2.4 扇贝多糖还原糖的鉴定

    精密称取0.1g扇贝多糖样品,溶解于100ml的蒸馏水,用吸量管吸取2ml 样品液于试管中。配制0.1g/mL氢氧化钠溶液(甲液)和0.05g/mL 硫酸铜溶液(乙液)。甲液和乙液按照1:1的体积比例混合均匀成斐林试剂。吸取1ml 斐林试剂于试管中,将试管放置于60℃的恒温水浴锅中加热2分钟。观察其颜色变化。若出现砖红色沉淀,则证明扇贝多糖具有还原性。

2.5 扇贝多糖的抗氧化性测定

2.5.1 实验试剂的准备

    制备pH 7. 4浓度0. 05 mol/LPBS溶剂:精密称取7.1600g Na2HPO4·12H2O 在烧杯中溶解完全后,转移至100ml容量瓶,加蒸馏水至刻度处,制成0.2mol/L Na2HPO4。精密称取3.1200g NaH2PO4·2H2O 在烧杯中溶解完全后,转移至100ml容量瓶,加蒸馏水至刻度处,制成0.2mol/L NaH2PO4。用吸量管汲取19ml 0.2mol/L Na2HPO481ml 0.2mol/L NaH2PO4,混合均匀后,制成0.2mol/L PBS溶剂。最后使用吸量管精确吸取25ml .2mol/L PBS溶剂,加水至100ml容量瓶的刻度处,即可制成pH 7. 4浓度0. 05 mol/LPBS溶剂。

制备5mmol/L 邻二氮菲:精密称取0.0990g 邻二氮菲,在烧杯中溶解完全后,转移至100ml容量瓶,加蒸馏水至刻度处即可。

制备7.5mmol/L硫酸亚铁溶液:精密称取0.2085g 硫酸亚铁,在烧杯中溶解完全后,转移至100ml容量瓶,加蒸馏水至刻度处即可。

    制备样品溶液:精密称取0.1000g 扇贝多糖样品,在烧杯中溶解完全后,转移至100ml容量瓶,加蒸馏水至刻度处即可。

2.5.2 试验步骤

    精确量取8. 0ml蒸馏水和2. 0 ml pH 7. 4浓度0. 05 mol/LPBS至试管中,作为空白参比管。精确量取 2. 0 ml PBS1. 0 ml 7.5mmol/L硫酸亚铁溶液、1. 5 ml 5mmol/L的邻二氮菲和5. 5 ml蒸馏水至试管中,作为未损伤管。精确量取2. 0 ml PBS1. 0 ml硫酸亚铁溶液、1. 5 ml邻二氮菲、4. 5 ml蒸馏水和1. 0 ml H2O2至试管中,作为损伤管。精确量取2. 0 ml PBS和不同体积的样品溶液,然后加蒸馏水至10 ml作为样品参比管。精确量取2. 0ml PBS1. 0ml 硫酸亚铁溶液、1. 5ml 邻二氮菲、不同体积的样品液和1. 0 ml 30%H2O2至试管中,然后加蒸馏水至10 ml作为样品管。[15]

    将全部试管放在37℃恒温水浴锅中保温一小时。在波长536nm 处测定吸光度。

清除率(% ) = [(A样品-A样参) -(A损伤-A空参) ]÷(A未损-A损伤)×100%

3 结果与分析

3.1 单因素实验

3.1.1 加酶量对扇贝多糖提取率的影响

    采用3.2的方法,在温度55℃,水浴超声波时间2.0 h,料液比1:40条件下,分别研究加酶量1.5%2.0%2.5%3.0%对扇贝多糖提取率的影响,结果见表3-1

表2  加酶量对扇贝多糖提取率的结果

 加酶量           重量/g      

 吸光度             提取率

 1.5%             1.2244

 2.0%             1.2689

 2.5%             1.3534

 3.0%             1.3213

 0.346              11.13%

 0.358              11.54%

 0.420              12.30%

 0.405              12.01%

 

    由表2可知,随着加酶量的增大,扇贝多糖的提取量会逐渐增大,呈现递增趋势。当加酶量为2.5%的时候多糖提取率明显最高。酶也是一种蛋白质,酶解后需要一起出去酶蛋白质和扇贝样品蛋白质,因此不宜加酶量太大,一方面可以降低除清蛋白质的难度,另一方面酶具有一定的多糖含量,可以减少对扇贝多糖提取率的影响。为此选定最佳的加酶量为2.5%

3.1.2 酶解温度对扇贝多糖提取率的影响

    采用3.2的方法,在水浴超声波时间2.0 h、料液比1:40和加酶量为2.0%的条件下,分别研究酶解温度为45℃、50℃、55℃和60℃对扇贝多糖提取率的影响,结果见表3-2

表3  酶解温度对扇贝多糖提取率的结果

 酶解温度/       重量/g      

 吸光度             提取率

   45             1.2276

   50             1.2668

   55             1.3461

   60             1.1371

 0.354              11.16%

 0.336              11.52%

 0.381              12.24%

 0.353              10.34%

如表3所示,随着水浴酶解温度的升高,扇贝多糖的提取率增加。而且水浴酶解温度对扇贝多糖提取率的影响相对较大,当水浴温度在55℃时,扇贝多糖的提取率是最高的。在55℃之后,多糖会因为温度过高而引起扇贝多糖氧化降解,影响扇贝多糖的提取率。因此55℃为最佳的酶解温度。

3.1.3 原始料液比对扇贝多糖提取率的影响

    采用3.2的方法,在温度55℃,水浴超声波时间2.0 h和加酶量为2.0%的条件下,分别研究原始料液比1:301:401:501:60对扇贝多糖提取率的影响,结果见表3-3

表4  原始料液比对扇贝多糖提取率的结果

 原始料液比       重量/g      

 吸光度             提取率

 1:30             1.1083

 1:40             1.1573

 1:50             0.9751

 1:60             0.9178

 0.319               10.08%

 0.342               10.52%

 0.301               8.86%

 0.297               8.34%

    从表4可知,扇贝多糖的提取率伴随原始料液比的增添而增添,当原始料液比在1:40的时候,其提取率最高。因此,原始料液比1:40为之最佳。

3.1.4 超声波时间对扇贝多糖提取率的影响

采用3.2的方法,在温度55℃,原始料液比1:40和加酶量为2.0%的条件下,分别研究水浴超声波时间为1.0h1.5h2.0h2.5h对扇贝多糖提取率的影响,结果见表3-4

表5  水浴超声波时间对扇贝多糖提取率的结果

水浴超声波时间/h  重量/g      

 吸光度             提取率

   1.0             1.0461

   1.5             1.0920

   2.0             1.0264

   2.5             0.9447

 0.280              9.51%

 0.283              9.93%

 0.285              9.33%

 0.321              8.59%

    从表5可知,水浴超声波时间对扇贝多糖提取率的影响比较大,刚开始的时候,随着水浴超声波时间的增加,扇贝多糖的提取率有所上升。当水浴超声波时间在1.5h时,达到扇贝多糖提取率的峰值。由于超声波可以传播能量,当扇贝多糖吸收太多的能量的时候,多糖的结构和生理活性就会发生变化,因此影响其提取率。水浴超声波时间为1.5h左右为最佳。

3.2 正交实验

由单因素试验确定了酶解法提取扇贝多糖的因素和水平。为了更好地确定扇贝多糖最佳的提取工艺,以加酶量、酶解温度、原始料液比和水浴超声波时间4个因素3个水平设计正交试验,试验方案见表五,试验结果见表6、表7

表6 正交试验的因素水平

水平

A加酶量     B酶解温度/      

 C原始料液比    D水浴超声波时间/h

 1

 2

 3

 2.25%          52.5

 2.5%           55

 2.75%          57.5

   1:35               1.25

   1:40               1.5

   1:45               1.75

                                                                    

正交试验的结果

水平

  A      B

  C      D       重量/g     吸光度

提取率/%

 1

 2

 3

 4

 5

 6

 7

 8

 9

K1

K2

K3

 1

 2

 3

极差R

主次顺序

优水平

优组合

  1      1

  1      2

  1      3

  2      1               

  2      2

  2      3

  3      1

  3      2

  3      3

31.4   32.38

31.64  32.22

33.68  32.12

10.47  10.79

10.55  10.74

11.23  10.71

0.76   0.08

C > A > D > B

 A3    B1

A3B1C1D3

  1       1       1.2080     0.244

  2       2       1.1085     0.265

  3       3       1.1374     0.234

  2       3       1.1583     0.257

  3       1       1.1050     0.312

  1       2       1.2171     0.247

  3       2       1.1964     0.313

  1       3       1.3304     0.361

  2       1       1.1787     0.335

34.13   31.75

31.33   32.01

31.26   32.96

11.38   10.58

10.44   10.67

10.42   10.99

 0.96    0.41

 

  C1     D3

 10.98

 10.08

 10.34

 10.53

 10.05

 11.06

 10.87

 12.09

 10.72

 

 

 

从表7的数据分析可知,对扇贝多糖提取率的影响的主次顺序为:原始料液比 > 加酶量水浴超声波时间 > 酶解温度。在同样的实验条件下,加酶量的最优水平为: 2.75%,酶解温度的最优水平为:52.5℃,原始料液比的最优水平为:1:35,水浴超声波时间的最优水平为:1.75h。因此扇贝多糖提取的最优组合为:加酶量为:2.75%,酶解温度为:52.5℃,原始料液比为:1:35和水浴超声波时间为:1.75h

3.3 扇贝多糖还原糖的鉴定

    加入试剂2分钟过后,试管中出现砖红色沉淀。因此证明扇贝多糖具有还原性。

3.4 扇贝多糖抗氧化结果及分析

抗氧化试验结果看表8

A空参=0.001             A未损=1.360                A损伤=1.347

扇贝多糖对·OH的清除作用

样品

样品最终浓度/ g/L

  样参吸光度

  样品吸光度

清除率/%

 

 

JPS

 

 

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.001

0.002

0.003

0.004

0.005

1.352

1.354

1.357

1.359

1.354

38.46

46.15

61.54

69.23

23.08

从表8可知,扇贝多糖在0.6~0.8g/L浓度范围内,对·OH的清除作用明显。说明扇贝多糖具有抗氧化作用。在化妆品行业中,按照一定的扇贝多糖比例,可以制造出既有保湿效果又有抗氧化的化妆水、面霜等。

由于根据理论而言,样品JPS的浓度越大,对·OH的清除作用越强,在JPS=1.0的时候,清除作用降幅很大,超出正常的理论值。分析实验结果,由于以上的数据要求精确,因此在使用吸量管的时候,出现较为严重的误差。

4 总结及展望

本实验采用效率较高的超声波酶解法提取扇贝多糖,采用超声波辅助酶解,可以加速多糖溶入溶剂中,木瓜蛋白酶的成本相对较低且容易购买,酶解法相对单纯的热水提取法提取时间更短,提取率高的。在单因素实验中,最佳的加酶量为2.5%,水浴酶解温度为55℃,原始料液比为1:40和超声波时间为1.5h。因此在正交试验中,分别以上述四个点作为因素。经正交试验研究后,发现扇贝多糖提取的最佳条件为:加酶量为2.75%,水浴酶解温度为55℃,原始料液比为1:35和超声波时间为1.75h。扇贝多糖在0.6~0.8g/L浓度范围内,对·OH的清除作用明显,抗氧化性更佳。

扇贝多糖的提取工艺和生物活性研究对人类的健康具有巨大的潜力。如今艾滋病、癌症、放射性疾病及各种免疫性疾病等疑难病不断滋长,已经严重影响了人类的健康发展。扇贝多糖具有抗病毒、增强免疫功能及抗肿瘤等生物活性。因此,可以将扇贝多糖应用于医药中,改善人类的健康问题。扇贝多糖的保湿性和抗氧化性可以应用于化妆品行业。我国的海洋资源丰富,扇贝多糖的发展前景广阔。

参考文献:

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作者简介:宋照风(1984年—),女,实验师,硕士研究生,主要从事实验室工作,研究方向为天然产物提取。通讯地址:广东省佛山市江湾一路18号佛山科学技术学院。E-mailsongzhaofeng012@163.com.联系电话:13929198277.

 



收稿日期:

基金项目:广东省科技计划项目(2013B020307017

作者简介:宋照风(1984-),女,硕士,实验师,E-mailsongzhaofeng012@163.com

    通讯作者:赵海全(1966-),男,博士,教授,E-mailfszhaohq@163.com

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